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    飼用乳酸菌的檢測方法圖文解釋

    2012/5/10 14:21:04   文章來源:原創   作者:強微生物   瀏覽次數:17933
    【字號:  
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    乳酸菌詳細檢測操作過程
    1. 作為飼用乳酸菌的用戶,自己掌握乳酸菌的檢測方法,尤其有必要
        飼用微生物添加劑效果在很大程度上取決于其中是否含有乳酸菌,因為乳酸菌是飼用微生物添加劑中無可爭辯、當之無愧的主角菌;
        但實際上市場上的飼用微生物添加劑中極少含有乳酸菌,即便是廠家標示含有乳酸菌,也不要輕易相信,眼見為實,親自檢測一下是硬道理;
        乳酸菌在常溫下貯存時,極易死亡失活,夏天往往數天就全部死光,乳酸菌的生產技術復雜,培養難度高,包埋保護技術要求高,這幾個原因是造成市場上極少有乳酸菌的主要原因,總之,自己親自檢測驗證是必要的,不然,可能您使用了多年的飼用微生物添加劑中,基本上就只有芽孢桿菌或酵母菌,根本沒有乳酸菌,這種事非常多。
        而只有含有耐貯存,耐制粒的乳酸菌的飼用微生物添加劑,其效果就是絕非凡響!為什么說乳酸菌才是飼用微生物添加劑中無可爭辯,當之無愧的主角,見網站相關文章的九條理由http://lac.hl99cn.com/show.asp?newsid=2070 。
        只有具備特殊的包埋保護的乳酸菌,才能在常溫下貯存和使用,好的乳酸菌制劑甚至可以耐受飼料制粒的要求,例如“強微牌”乳酸糞腸球菌就是耐貯存,耐制料的乳酸菌制品。
     
    下面介紹乳酸菌的檢測方法——傾注法并產生透明圈的檢測方法的原理,和操作技術
        針對用戶大多數并不是微生物專業人員,編寫本文時,特意使用淺顯易懂的文字進行描述;
    一. 本檢測方法的原理
    1.1 檢測過程簡述
    乳酸菌懸液的制備
        將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋了200倍,即0.5克樣品,稀釋到了100克水溶液),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL三角瓶中,置于振蕩器或搖床上劇烈搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
    稀釋到適當倍數
        根據所待檢測的樣品可能的乳酸菌含量,進行適當的稀釋操作,例如如果估計樣品的含乳酸菌活菌數為200億/克左右,則建議稀釋2億倍,這樣將來在90mm平板上培養時,會長出大約100個乳酸菌落,比較便于計數,總之,控制平板培養皿上的乳酸菌落數量在30~300個的范圍內,比較便于計數。
        我公司“強微”牌乳酸糞腸球菌系列產品,含乳酸菌活菌數的分析保證值均在100~300億/克范圍內(剛出廠的則在240--720億/克以上),所以,建議稀釋2--3億倍以上即可。
        稀釋方法用無菌生理鹽水,在250mL三角瓶中進行稀釋,方法見后述。
    倒制平板,即接種
        倒制平板在超凈工作臺上進行,養殖戶可使用一盞簡單的酒精燈和一個干凈的操作臺就可操作;
        即事先配制好,并滅菌處理的檢測用瓊脂培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,使瓊脂培養基呈溶解狀態,置于操作臺旁邊備用;(養殖戶可先不從壓力鍋中取出,在壓力鍋維持一定的溫度,從而也不會凝固)
        取事先干熱滅菌處理后的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置于操作臺上備用;(養殖戶的培養皿平板可在壓力鍋中進行蒸汽滅菌處理)
        在無菌條件下(打開超凈工作臺無菌風,或養殖戶點上酒精燈),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
    培養箱中進行培養
        將前面倒制好的平板,倒轉(即蓋子在下面),放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
    1.2 檢測的原理介紹
       本文介紹的乳酸菌檢測方法,是我公司用來檢測乳酸糞腸球菌的專利技術之一,檢測乳酸菌的培養基配方如下:
        用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,115~121℃滅菌20min,滅菌后放置水浴50℃保溫備用。
        可以看到,與普通的瓊脂培養基配方有兩個比較明顯的區別:
        ① 其中瓊脂的用量只有1%,比常規瓊脂培養基的2%用量少了一半,目的是降低瓊脂凝固溫度,為了在倒制平板時,使培養基能在較低的溫度下與熱敏性的乳酸菌混合,并一直呈溶解狀態,混合均勻后,才慢慢凝固;
        ② 同時,添加了1%的碳酸鈣,由于碳酸鈣難溶于水,所以,加入碳酸鈣后的瓊脂平板培養基為混濁狀態,為的是在將來培養乳酸菌時,乳酸菌在培養過程中產生乳酸,把菌落周圍的難溶性的碳酸鈣溶解,成為可溶性的乳酸鈣,并使菌落周圍的培養基變得透明,在菌落周圍產生透明圈,從而判斷其為乳酸菌。
     
    二. 檢測儀器設備要求
    2.1 正規的實驗室檢測乳酸菌需要如下儀器和設備:
        ① 恒溫培養箱;1000~2000元/臺;
        ② 恒溫干燥滅菌箱;1000~2000元/臺;
        ③ 電子天平;200元/臺左右;
        ④ 滅菌鍋;醫用的,或手提式高壓滅菌鍋;500元/臺左右;
        ⑤ 玻璃儀器(滅菌的9cm培養皿,10mL、1mL的吸管,250mL三角瓶,玻璃珠一包等)
        ⑥ 顯微鏡;必要時觀察計數乳酸菌總數;檢測活菌幾乎不需要它。
        ⑦ 超凈工作臺;用于接種操作;
        ⑧ 其他如橡皮筋,牛皮紙或報紙;
        ⑨ 記號筆
     
    2.2 養殖戶或飼料廠簡單地檢測乳酸菌,需要的最簡單的儀器和設備
        ① 恒溫培養箱;1000~2000元/臺;
        ② 酒精燈;代替正規實驗室的超凈工作臺,在火焰上接種操作;
        ③ 天平;最簡單的小天平,數十元一臺;
        ④ 壓力鍋;家庭蒸飯用的就行(但不是電飯煲);
        ⑤ 一個干凈的操作臺面;
        ⑥ 玻璃儀器(滅菌的9cm培養皿,10mL、1mL的吸管各數根,250mL三角瓶10個以上,玻璃珠一包等),這幾樣加起來也就100多元;
        ⑦ 其他如橡皮筋,牛皮紙或報紙;
        ⑧ 記號筆
     
    三. 藥品
        無論是正規實驗室,還是養殖戶或飼料廠非正規檢測,都需要以下藥品:蛋白胨,酵母膏,葡萄糖,氯化鈉,碳酸鈣。
     
    四、針對正規實驗室的檢測方法
    4. 檢測步驟(針對正規實驗室)
    4.1 先準備干熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
        干熱滅菌是指在恒溫干燥滅菌箱中,以140℃以上的干熱空氣,對箱內物品進行消毒滅菌,主要用于玻璃儀器的滅菌處理。
        用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包扎好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包扎的玻璃儀器的數量。包扎效果見圖示。
        以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品需要至少4個三角瓶;
        將上述三角瓶,以及包扎好的培養皿,移液管等,放入恒溫干燥滅菌箱中,于140℃以上滅菌3小時以上。備用。
     
    4.2 再準備好濕熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
        濕熱滅菌是指在滅菌鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程,主要用于配制好的培養基滅菌,無菌水制作等的消毒處理。
    ① 平板(或叫培養皿)培養基的配制
        用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解于250或500mL三角瓶中,再放入滅菌鍋內消毒滅菌處理,115~121℃滅菌20min,滅菌后放置水浴50℃保溫備用。
    ② 無菌生理鹽水的配制
        通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配制好后,進行滅菌處理。
        生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解于100毫升水中即可,然后,放于滅菌鍋內滅菌處理。備用。
     
    4.3 樣品的制備(針對正規實驗室)
    4.3.1 乳酸菌懸液的制備
        將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL滅菌三角瓶中,在搖床上于180rpm轉速下,搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
    4.3.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
        用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的制備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
       再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
       再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
     
    4.4 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
        倒制平板在超凈工作臺上進行,以保持無菌環境中操作;
        把事先配制好,并滅菌處理后的檢測用培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,置于操作臺旁邊備用;
        取事先干熱滅菌處理后的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置于操作臺上備用;
        在無菌條件下(打開超凈工作臺無菌風),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
    4.5 培養箱中進行培養
        將前面倒制好的平板,放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
     
    4.6 計數
        從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
        在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
        每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
        記錄計數值。
     
    4.7. 結果計算
        計算公式:
        樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2
     
    五、針對養殖戶或中小飼料廠的簡單檢測方法
    5. 檢測步驟(針對養殖戶或中小飼料廠
        養殖戶或中小飼料廠,如果沒有干燥滅菌箱,可以將全部需要滅菌消毒的物品,都用濕熱滅菌法消毒,即都使用蒸飯用的壓力鍋消毒即可。
        注意:壓力鍋消毒時,要事先在壓力鍋內墊上一個鋁墊片,支起一個內膽,在內膽中放置待消毒物品,墊片處放清水作為蒸汽發生用水,具體見圖未:
        濕熱滅菌是指在壓力鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程。
     
    5.1 再準備好壓力鍋中需要滅菌的物品(針對養殖戶或中小飼料廠
    ① 平板(或叫培養皿)培養基的配制
        用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解于250或500mL三角瓶中,再放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
        因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最后來操作這一步,即所有其他的東西都準備好后,最后來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
    ② 無菌生理鹽水的配制
        通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配制好后,進行滅菌處理。
        生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解于100毫升水中即可,然后,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
    其他需要壓力鍋滅菌處理的物品
        用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包扎好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包扎的玻璃儀器的數量。包扎效果見圖示。
        以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品至少需要4個三角瓶;
        將上述三角瓶,以及包扎好的培養皿,移液管等,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
     
    5.2 樣品的制備(針對正規實驗室)
    5.2.1 乳酸菌懸液的制備
        將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL滅菌三角瓶中,養殖戶沒有搖床,只能辛苦點,用手握好三角瓶,用力搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
    5.2.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
        用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的制備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
       再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
       再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
     
    5.3 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
        養殖戶沒有超凈工作臺,倒制平板在酒精燈的火焰旁邊進行,但必須有一個比較干凈的操作臺,如瓷板操作臺面上操作,以保持無菌環境中操作;
    5.3.1 保持平板培養基的溶解狀態
        因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最后來操作這一步,即所有其他的東西都準備好后,最后來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
    5.3.2 倒平板操作
        取事先干熱滅菌處理后的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置于操作臺上備用;
        在無菌條件下(點上酒精燈,盡量在避風處,空氣干燥清爽的環境中,以及比較干凈的瓷板操作平臺上操作),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
        注意以上操作,盡量在酒精燈的火焰旁邊操作。
        待平板中的培養基,冷卻凝固后,移入培養箱中進行培養。
     
    5.4 進行培養
        將前面倒制好的平板,放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
        如果養殖戶沒有培養箱,也可以在仔豬或雛雞保溫箱中進行培養,熱源采用紅外燈熱源,但注意要使用干凈的箱子或容器來培養。
     
    5.5 計數
        從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
        在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
        每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
        記錄計數值。
     
    5.6. 結果計算
        計算公式:
        樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     

     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     

     


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     評論網友:宜春   評論時間:2016/10/8 8:58:18
      您好,一起滅菌,沒有問題的;
     評論網友:請教   評論時間:2016/9/27 15:28:55
    培養基和碳酸鈣是分開來滅菌最后倒平板時再合并在一起還是一起滅菌?
     評論網友:請教   評論時間:2016/9/27 9:30:10
    培養基和碳酸鈣是分開來滅菌最后倒平板時再合并在一起還是一起滅菌?
     評論網友:宜春   評論時間:2015/5/30 21:02:41
    自然PH。
     評論網友:495650828   評論時間:2015/5/30 13:59:35
    培養基的PH值調到多少呢
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