不同復合益生菌對錦江黃牛瘤胃體外發酵的影響試驗報告
（江西農業大學江西省高校動物營養重點實驗室 瞿明仁 南昌 330045）
（宜春強微生物科技有限公司 宜春 336000）
筆者注：本試驗是為強微公司將來的新產品：“強微反芻寶”，所進行了前期探索性試驗，是強微公司與江西農大協同創新產學研合作項目之一。
摘要：為探討四種不同組成的復合益生菌制劑對錦江黃牛瘤胃體外發酵的影響，采用體外培養方法進行研究, 設5個組，即不添復合益生菌的基礎日糧為對照組，4個試驗組分別添加I、II、III和IV號復合益生菌，添加量均為在基礎日糧中添加200mg/kg。進行體外培養24小時，測定培養液各項指標。結果表明：（1）I、II、III、IV復合益生菌和對照組的培養液pH值均在正常范圍內。（2）I、II、III復合益生菌的24小時總產氣量與對照組有顯著的提高( P <0. 05)，以II號復合益生菌的產氣量最高為170.50 ml；（3） I、II號復合益生菌微生物蛋白含量極顯著高于其他組( P <0. 01)，其中II號復合益生菌的微生物蛋白含量最高達270.43 mg/100ml；（4）I、II、III復合益生菌氨態氮濃度極顯著低于對照組和第IV號復合益生菌( P <0. 01)；（5）II、III號復合益生菌干物質降解率極顯著高于對照組( P <0. 01)；（6）I、II、III號復合益生菌丙酸和總VFA濃度極顯著高于對照組( P <0. 01)，II號丙酸濃度、總揮發性脂肪酸最高，乙酸/丙酸值極顯著低于對照組 ( P <0. 01)。
結果提示:添加復合益生菌能夠穩定瘤胃內環境，促進瘤胃發酵功能改善;以II號復合益生菌效果最佳，但最佳添加量和體內效果有待進一步研究。
關鍵詞：復合益生菌；錦江黃牛；瘤胃；體外發酵
微生態制劑以其天然、無毒、無副作用、無殘留、安全可靠、不污染環境的優越性成為發展綠色畜禽產品和替代抗生素首推的飼料添加劑之一。我國農業部規定可用于生產微生態制劑的微生物有16 種, 主要為乳酸菌類，酵母菌類和芽孢桿菌類三大類[ 1] 。本課題組研究發現乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強，處理3小時，存活仍有95%以上（瞿明仁等，2012）[ 2]。大量研究證明, 科學的復合制劑對動物有協同和互補作用。因此，本課題組在前期研究的基礎上，以產乳酸糞腸球菌、酵母菌和芽孢桿菌（地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌）為主，配制了四種復合益生菌。本研究利用體外培養的方法，評定四種復合益生菌制劑對江西錦江黃牛瘤胃體外發酵培養的影響，以期篩選出最佳的復合益生菌組合，為在肉牛中的生產應用提供技術支持。
１ 材料與方法
1.1復合益生菌：
由江西農業大學動物營養與飼料科學重點實驗室與宜春強微生物科技有限公司聯合研制和生產，代號分別為I、II、III、IV，共四種。復合益生菌由產乳酸糞腸球菌、酵母菌和芽孢桿菌（地衣芽孢桿菌和枯草芽孢）按一定比例和工藝制備而成，見表1。
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表1 復合益生菌組成
Table 1 The composition of complex-probiotic-preparations
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復合益生菌complex
-probiotic-preparations
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組 成composition
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I
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乳酸糞腸球菌、酵母菌為主，加適量芽孢桿菌
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II
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以酵母菌為主，加適量的乳酸糞腸球菌、芽孢桿菌
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III
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以酵母菌、芽孢桿菌次為主，加適量乳酸糞腸球菌
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IV
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主要以酵母菌及其代謝產物為主
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1.2 試驗動物與基礎日糧
選用2 頭體重為( 275±15) kg 安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛，以供瘤胃液的采集。試驗動物每天飼喂2 次( 08: 00 和18: 00) ，自由飲水�；A日糧為玉米-豆粕-稻草型日糧，按肉牛1.3倍維持需要配制，精粗比為60∶40，基礎日糧組成和營養水平見表1。
體外培養試驗設5個組，即不添復合益生菌的基礎日糧為對照組，4個試驗組分別添加I、II、III和IV號復合益生菌，添加量均為在基礎日糧中添加200mg/kg。
表2 基礎日糧組成及營養水平
Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet
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日糧組成
Ingredient
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比例（%）
Percentage
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營養水平
Nutrient levels
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含量
Content
|
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稻草 Straw
玉米Corn
豆粕Soybean
石粉 Limestone
預混料 Premix
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40.0
52.8
5.4
0.3
1.5
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干物質 DM（%）
綜合凈能 NE（MJ/kg，DM）
粗蛋白 CP（%，DM）
P (%,DM)
Ca（%，DM）
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88.97
6.10
8.82
0.31
0.47
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注：每kg預混料含：維生素A 200 000IU；維生素D3 30000IU；維生素E 600 IU；銅 300mg；鐵 2000mg；錳 1200mg；鋅 1500mg；硒 20mg；碘 30mg；鈷 10mg;鈣 100-200g；磷 50-100g；食鹽 14.00-20.00%
1.3體外培養試驗
1.3.1體外培養裝置
體外批次培養裝置參照盧德勛等[3]和程茂基[4]的方法進行。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和震蕩速率可調。培養瓶為瓶口安裝有橡皮塞的150 mL奶瓶，橡皮塞上接有帶三通閥的橡膠管，三通閥可打開和關閉，三通閥一端與25mL 醫用玻璃注射器相連，注射器用于測定體外培養過程中的產氣量。
1.3.2瘤胃液采集
于晨飼前由2頭錦江黃牛瘤胃內上下左右( 背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊) 不同位點采集足量瘤胃液，灌入經預熱達39 ℃并通有CO2的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39 ℃ 蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回實驗，經4層紗布過濾后持續通入CO2氣體5min，然后迅速分裝至已預熱好并裝有培養底物和人工唾液的培養瓶內(每個培養瓶加20mL瘤胃液)。接通培養瓶和注射器，打開振蕩開關，開始培養。
1.4 樣品的預處理
培養24h后，將培養瓶取出，立即測定其pH值，然后將培養物用紗布過濾，濾渣無損失地轉移入100ml大坩堝中，置于65℃烘箱中烘干，以測定干物質降解率。濾液轉移至
100ml大離心管中，以1500r/min離心15min，去除原蟲和飼料大顆粒。取上清液保存，以備分析BCP濃度、NH3-N濃度和VFA濃度。
1. 5 指標的測定
1.5.1 產氣量：每隔半小時記錄注射器的氣體量，記錄完后排氣，累計培養24小時的總產氣量。
1.5.2 瘤胃液pH 值：培養24小時后立即用PHS-320酸度計（上海密通機電科技有限公司）直接測定。
1.5.3 瘤胃液NH3-N濃度：參照馮宗慈等的比色法進行測定[5] 。
1.5.4 瘤胃液菌體蛋白（MCP）的測定：
取經預處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液10ml，以16000×g離心20min，棄去上清液，沉淀的細菌部分加入9ml 10%三氯乙酸溶液，混勻，再以4000r/min離心10min，取沉淀物加入5%氫氧化鈉溶解，然后稀釋至25ml。此稀釋液又經4000r/min離心10min，取上清液在紫外分光光度計上用280nm和260nm波長進行比色。應用下面公式求得細菌蛋白質含量：
細菌蛋白質含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260) ×稀釋倍數
1.5.5 瘤胃液VFA 濃度。按照戈婷婷等的氣相色譜法進行測定[6]。
1.6 數據處理
采用Excel 2003和Spss16. 0軟件對試驗數據進行方差分析和顯著性檢驗。
2 結果與分析
2.1不同復合益生菌體外培養產氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質降解率
表3 不同復合益生菌制劑對培養液產氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質降解率影響
Table 3 Effects of different kind of complex-probiotic-preparations on gas volume, pH, MCP, NH3-N and DM
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組別
Groups
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pH值
pH value
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產氣量
gas volume ml
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氨態氮NH3-N
mg/100ml
|
微生物蛋白MCP
mg/100ml
|
干物質降解率DM,%
|
|
對照組control
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5.18±0.01
|
157.00±3.0a
|
22.47±0.09cB
|
220.67±3.84aA
|
31.16±0.05aA
|
|
I
|
5.17±0.01
|
168.00±1.5b
|
20.96±0.02aA
|
250.24±1.46cB
|
32.34±0.39bcAB
|
|
II
|
5.17±0.01
|
170.50±1.5b
|
20.74±0.16aA
|
270.43±1.69dC
|
33.08±0.20cC
|
|
III
|
5.18±0.01
|
169.00±2.5b
|
21.08±0.08aA
|
230.62±1.62bA
|
32.64±0.14cBC
|
|
IV
|
5.17±0.01
|
163.50±1.5ab
|
21.99±0.03bB
|
223.72±3.57abA
|
31.70±0.06abAB
|
注: 同列肩標相同字母表示差異不顯著(P >0. 05 )，不同小寫字母表示差異顯著(P < 0. 05 ), 不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)。下表同。
Note: Same small letters in the column stand for not significant differences (P >0. 05), different small letters stand for significant differences (P< 0. 05), different capital letters stand for extremely significant differences (P< 0. 01), the same as follows.
由表3可見，添加I、II、III、IV復合益生菌和對照組的培養液pH值均在正常范圍內。添加I、II、III復合益生菌的24小時總產氣量與對照組有顯著的提高( P <0. 05)，各處理組間差異不顯著( P >0. 05)但以II號復合益生菌的產氣量最高為170.50 ml； I、II號復合益生菌微生物蛋白含量極顯著高于其他組( P <0. 01)，其中II號復合益生菌的微生物蛋白含量最高達270.43 mg/100ml，而且顯著高于I、III號( P <0. 05)；I、II、III復合益生菌氨態氮濃度極顯著低于對照組和第IV號復合益生菌( P <0. 01)，IV號復合益生菌顯著低于對照組( P <0. 05)；II、III號復合益生菌干物質降解率極顯著高于對照組( P <0. 01).
2.2不同復合益生菌制劑瘤胃液揮發性脂肪酸濃度
表4 添加不同復合益生菌對瘤胃液揮發性脂肪酸濃度的影響
Table 4 Effects of different kind of complex-probiotic-preparations on VFA
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組別Groups
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乙酸mmol /L
Acetic acid
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丙酸mmol /L
Propionic acid
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丁酸mmol /L
Butyric acid
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總VFAmmol /L
Total fatty acids
|
乙酸/丙酸
Acetic acid / propionic acid
|
|
對照組control
|
81.07±0.21a
|
48.25±0.55aA
|
10.37±0.28a
|
139.69±0.17aA
|
1.68±0.01cB
|
|
I
|
81.87±0.16bc
|
50.80±0.23bB
|
11.84±0.41b
|
144.51±0.99bB
|
1.61±0.01bA
|
|
II
|
82.10±0.26c
|
52.08±0.19cB
|
11.77±0.13b
|
145.96±0.63bB
|
1.58±0.01aA
|
|
III
|
82.17±0.08c
|
51.86±0.07bcB
|
11.86±0.05b
|
145.89±0.10bB
|
1.58±0.01aA
|
|
IV
|
81.18±0.26ab
|
48.69±0.09aA
|
10.80±0.20a
|
140.67±0.12aA
|
1.67±0.01cB
|
由表4可見，與對照組相比，I、II、III號復合益生菌的乙酸和丁酸濃度顯著高于對照組和IV號復合益生菌( P <0. 05)，丙酸和總VFA濃度極顯著高于對照組( P <0. 01)，乙酸/丙酸值極顯著低于對照組和IV復合益生菌( P <0. 01)，而IV號復合益生菌揮發酸濃度雖比對照組高一些但差異不顯著( P >0. 05)。各處理組之間比較，II號丙酸濃度為52.08mmol /L顯著高于I 號( P <0. 05)，I號和III號差異不顯著( P >0. 05)；II號總揮發性脂肪酸濃度最高，但是處理組間差異不顯著( P >0. 05)，II、III號的乙酸/丙酸值顯著低于I 號( P <0. 05)。
3 討 論
3.1復合益生菌對瘤胃內環境穩定性的影響
瘤胃pH 是評價瘤胃內環境是否穩定的基本指標, 它主要受唾液、飼糧及瘤胃微生物區系的影響。本試驗體外培養24小時后各組瘤胃液pH都較低，這可能是由于本試驗的精粗比為6：4比較高，體外培養試驗不能像體內試驗那樣，將微生物代謝產生的有機酸吸收、排出或中和，再加上，使得產生的酸一直在培養瓶中蓄積，導致pH值較低。但各組pH值與對照組無顯著差異，說明添加四種符合益生菌沒有破壞瘤胃內環境的穩定性。姜艷美[7]等研究發現添加釀酒酵母菌對人工瘤胃酸堿內環境沒有造成不良影響，瘤胃pH差異不顯著,劉彩娟等[8]通過飼養試驗表明添加復合益生菌對奶牛瘤胃pH影響不顯著( P <0. 05) 這些研究結果與本研究一致，說明使用復合益生菌不影響瘤胃pH, 而且可能對瘤胃內環境具有穩定作用，促進瘤胃微生物在良好的瘤胃環境下生長繁殖。
3.2復合益生菌對瘤胃發酵功能的影響
本試驗發現，添加復合益生菌24小時總產氣量與對照組有顯著的提高( P <0. 05)，說明添加復合益生菌后，瘤胃微生物生長繁殖旺盛。而且I、II號復合益生菌微生物蛋白含量極顯著高于對照組( P <0. 01)，其中II號復合益生菌的微生物蛋白含量最高達270.43 mg/100ml；I、II、III復合益生菌氨態氮濃度極顯著低于對照組 ( P <0. 01)， II、III號復合益生菌干物質降解率極顯著高于對照組( P <0. 01). I、II、III號復合益生菌的丙酸和總VFA濃度極顯著高于對照組( P <0. 01)，乙酸/丙酸值極顯著低于對照組 ( P <0. 01)，Beauchemin 等[9] 報道,給育肥牛飼喂屎腸球菌能夠提高瘤胃丙酸的濃度。Miller-Webster[ 10] 認為, 高濃度的VFA, 尤其是高濃度的丙酸可保證牛奶中乳糖含量。Harrison報道, 酵母培養基添加于荷斯坦乳牛的日糧中, 使瘤胃內乙酸、乙酸與丙酸比例降低。楊朋飛（2009）[11]研究表明：奶牛每天飼喂5g BLCS微生態制劑可改善奶牛瘤胃發酵功能,顯著降低瘤胃內NH3-N濃度,提高菌體蛋白(BCP)、乙酸、丙酸與總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度,這與本研究結果一致，說明瘤胃發酵功能得到了改善。
3.3復合益生菌組成對瘤胃發酵功能影響及適宜組成
易維學(2010) [12]研究表明糞腸球菌和枯草芽孢桿菌均可較好的抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長；糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌可以起到較好的促生長作用。范利霞（2010）[13]研究表明,乳酸菌、芽孢桿菌產生的有機酸及其代謝產物對一些病原菌有抑制作用,并能激活免疫活性細胞,增強機體免疫力;酵母培養物營養豐富,可促進有益菌的生長、抑制病原菌的繁殖,提高機體免疫能力,并對防治畜禽消化道系統疾病起到有益作用。本課題組研制的I、II、III號復合益生菌是以酵母菌、乳酸糞腸球菌、芽孢桿菌復配而成的。本課題組研制的四種復合益生菌對瘤胃內環境具有穩定作用，同時改善了瘤胃發酵功能是與酵母菌、乳酸糞腸球菌、芽孢桿菌等3種微生物特性和功能相符合的。從研究結果來看，以II號復合益生菌效果最佳，但最佳添加量有待進一步研究。
4 結 論
1、添加復合益生菌能夠穩定瘤胃內環境，促進瘤胃發酵功能改善
2、在以II號復合益生菌效果最佳，但最佳添加量和體內效果有待進一步研究。
參考文獻：
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[2] 包淋斌，鄔向東，瞿明仁等. 乳酸糞腸球菌對pH、胃液、腸液、膽鹽耐受性研究.2012年待發表
[3] 盧德勛，謝崇文.現代反色動物營養研究方法和技術[M].北京:農業出版社，1991
[4] 程茂基.綿羊瘤胃內寡膚的產生、降解、吸收、流通與微生物攝取規律的研究[D].呼和浩特:內蒙古農業大學，2000
[5] 馮宗慈, 高民. 通過比色法測定瘤胃液氨氮含量方法的改進[ J]. 內蒙古畜牧科學, 1993( 4): 40- 41
[6] 戈婷婷,瞿明仁. 功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃發酵及微生物生長效率的影響[ J].動物營養學報,2012， 24( 3) : 557-562
[7] 姜艷美.酵母菌培養物對瘤胃發酵的影響[ J].動物營養學報,2008.
[8] 劉彩娟. 飼糧中添加復合益生菌對奶牛瘤胃發酵及纖維素酶活的影響
[9] Beauchemin K A ,Yang W Z ,Morgavi D P ,et al . Effect s of bacterial direct fed microbials and yeast on site and extent of digestion , blood chemistry , and subclinical ruminal acidosis in feedlot cattle [J ] . J Anim Sci ,2003 ,81 :162821640.
[10] Miller-Webster T, Hoover W H , Holt M , Nocek J E. Influence of y east culture on ruminal microbial metabolism in continuous culture. Journal of Dairy Science, 2002, 85( 8) : 2009- 2014.
[11]楊朋飛. 微生態制劑-BLCS對奶牛瘤胃發酵特性、產奶性能及營養物質消化率的影響[D]. 內蒙古農業大學碩士學位論文，2009.
[12]易維學. 飼用糞腸球菌和枯草芽孢桿菌的體外評價研究[D]. 華中農業大學碩士學位論文，2010.
[13] 范利霞. 復合微生態制劑的研制及其對反芻動物免疫機能的影響[D]. 內蒙古農業大學碩士學位論文，2010.
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