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    利用微生物菌體開發蛋白飼料資源(三)

    2007/6/14 18:06:51   文章來源:宜春強微高新技術專利產品開發中心   作者:鐘啟平   瀏覽次數:20009
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    本文發表在《畜禽業》雜志1999年第5期上
    宜春強微高新技術專利產品開發中心       鐘啟平

     3、利用微生物菌體生產SCP有關問題
    3.1 條件

     為使利用微生物生產SCP實用化,必須滿足以下條件:

    3.1.1 原料廉價,并且充足而易于收集。
    3.1.2生長速度和生長效率高,菌體收率高。
    3.1.3易培養,最好是較為粗放,可連續生產。
    3.1.4菌體容易收集,即下游分離工藝簡單。
    3.1.5廢水問題少,不產生二次污染。
    3.1.6 產品蛋白質含量高,氨基酸組成合理,生物活性物質含量多等。
    3.1.7 符合國情和市場需求。
    3.1.8 無病原性和毒性。
         關于原料的問題,我們在前面已經進行了系統的闡述,其它問題則基本上為技術處理上的問題,我們分別進行闡述和論述。
    3.2 生產效率
      生產效率是指單位時間內,單位容積中的菌體產量,對于固態發酵而言,則是指單位時間內的單位菌體轉化率。
       dx/dt=ux  式中:dx/dt-----生長速度  (kg/m3.h)  
    u-----比生長速率 (/h)  x----某一時刻的菌體濃度  (kg/m3)
        一般說來,細菌的比生長速率較大,酵母次之,霉菌最小,但霉菌也有比生長速率較大的。酵母菌的生長速度隨著原料的不同,而在2---4kg/m3.h變動,氫細菌生長速度為3.14kg/m3.h,而植物有機物生產效率最高的熱帶雨林和甘蔗的生長速度是500kg/m3.年左右,在熱帶地區培養光合成藻類的生長速度也大至與此相同,可見與此相比,微生物的生產效率可謂巨大,且不受季節,氣候和地區所限制,可實現工業化生產。
        在固體發酵中,基料是固態,不流動,物質交換少,細胞與基料的接觸面少,溝通也少,故而會防礙生長效率的提高,(它僅靠菌絲的蔓廷生長),所以較高的接種量是必需的,可增加微生物細胞的發源點,大大縮短發酵周期,如酵母菌的接種量要達到1%,霉菌孢子的接種量也至少0.1%(而若是液體發酵則只需要0 .01%)。
    3.3 菌體收率
       固體發酵中的菌體轉化率可以從產品檢測到的每克干物質所含的細胞數,再通過計算而得,計算公式如下;
       固態發酵菌體轉化率(%)=(A/116 + B/650)× D × 100%  kg/kg
     式中:A----鏡檢中的大酵母細胞(如常用于固態發酵的扣囊擬內孢霉或皮狀絲孢酵母)億個/克
           B----鏡檢中的小酵母細胞(如常用的輔助菌種擲孢酵母,紅發夫酵母,鐵紅酵母,產朊假絲酵母,解脂酵母,紅酵母等)億個/克。
           D-----一種系數,在發酵后期,有很多細胞發生自溶,或引進自溶工藝以提高產品營養價值等,這樣就使檢測到的表觀細胞數信偏低,根據筆者多年的試驗結果,D值在1.2---1.9之間,尤其對于使用了曲霉菌的固態發酵來說,由于其菌絲無法計數,故而D值往往在1.5以上。
          116-----為扣囊擬內孢霉酵母菌每克純細胞中的細胞數,億個/克。
          650----為輔助酵母菌每克純酵母中的細胞數,億個/克。
       對于固態發酵來說,菌體轉化率即為成品中,菌體占產品總量的百分比。一般在10—40%之間,轉化率越高,產品得率就越少,這是因為在轉化過程中,消耗了基料中的碳水化合物作為能源,一部分碳源變成二氧化碳揮發掉了,而產品是菌體與培養基殘基的總和。當然,轉化率越高,產品的生物活性也越高,營養價值越豐富,粗蛋白含量也越高。
        上述公式是事后檢驗方法,可用來試驗哪些原料的碳源適合于用來固態發酵。
        菌體產量的預期值,則一般按與碳源基質完全氧化所得的能量ATP的摩爾數成正比的方法估算。通過多次試驗得知,以1kg的葡萄糖為碳源基質預期的菌體產量是0.5kg,而由1mol的葡萄糖完全氧化可生成38mol的ATP(前提條件是充分供氧及其它元素營養條件具備的情況下)。根據這一前提,若能推斷出從1mol其它基質生成的ATP的摩爾數的話,即可以計算出該基質的菌體產量預期值,(見表8)
       表8:由不同的碳源獲得ATP的產量及菌體預期收率
    基質
    ATP產量
    菌體產量(g/g)
    Mol/mol
    化為g/g
    葡萄糖
    正十二烷
    乙醇
    乙酸
    甲醇(細菌)
    甲醇(酵母)
    甲烷
    氫(細菌)
    38
    99
    17
    11
    9
    6
    6
    2—3
    0.21
    0.582
    0.37
    0.18
    0.28
    0.19
    0.37
    1.0—1.5
    0.5
    1.385
    0.88
    0.43
    0.67
    0.45
    0.88
    2.37—3.55
      例如:正烷烴完全氧化,由1mol正十二烷烴可生成99molATP,則菌體產量預期值應為1.385kg/kg。
      所以在發酵過程中,碳源的主要作用是提供能量,部分作為菌體的細胞碳骨架,其它物質(如氨基酸,維生素,無機鹽等)則主要用來合成RNA,DNA,蛋白質,酶,脂質,多糖,激素等,進而進一步構成核糖體,線粒體,細胞膜------等細胞器,再進一步合成細胞。而能量則來自于碳源的氧化磷酸化(好氧時),或基質水平磷酸化(缺氧時),碳源在好氧時主要變成二氧化碳,而在厭氧時主要生成乳酸、乙醇、醋酸等。一般來講,好氧固態發酵物質消耗大,也即這個原因,但菌體轉化率比厭氧時要高得多,實踐中要根據不同的應用目的,來選擇不同的發酵方式。
        國內固態發酵生產SCP大多為高蛋白基料水平上的固態發酵,基質中作為能源物質的碳水化合物較少,發酵一定時間后,微生物便會分解基質中的蛋白質和氨基酸,以利用其中的碳骨架作為能源,同時脫氫產生刺鼻的氨氣,這是十分不經濟的,也是失敗的。故而必須嚴格控制發酵時間,使之在30小時之內結束發酵,或適當提高基料中的碳水化合物含量。發酵目的應以適度水解基料中蛋白質,以提高其消化率,并產生生物活性物質為主,而追求高的菌體轉化率是不現實的。
    3.4 生產上的問題
        對于液體深層發酵來講,機械化程度較高,操作簡單,技術也很成熟,生產上一般沒有問題,當然其最大的壁壘是投資巨大。
       對于固態發酵來講,則存在以下問題:
    3.4.1 單位面積產量小。即占地面積大,而料厚又受到限制,太厚則通風散熱均成問題。
    3.4.2 傳質問題:經常出現的情況是,在實驗室不成問題的通風散熱,菌絲擴大問題,一到大生產中,卻往往造成燒料,產氨味等傳質問題,盡管加裝了攪拌設備也往往防不勝防。
        最直接的解決方法是,用大接種量,增加發菌點,然后控制在20小時之內結束發酵,即在問題尚未出現之前就結束發酵。
    3.4.3 檢測問題:在液體深層發酵法中,可以用電子計算機進行控制培養。但在固態發酵中,關于PH值、溫度、基質含水量、菌體增殖量等在培養過程中的變化檢測,幾乎是不可能的。
        我們常常見到這樣的情況:插入料中的溫度計顯示是35度,但實際上已經超過了40度,因為風機一開,溫度值馬上上升到了40度以上,這就是因為傳質不均的結果。
    3.4.4 勞動強度大,如何在固態發酵中引進自動化的設施將是今后要研究的課題。
    3.4.5 當然固態發酵也具有液體深層發酵所沒有的優勢。只要選擇好適應的菌種,固體發酵具有無比的發展潛力,尤其是在高附加值產品的開發上,許多單位已能用固態發酵生產微生態制劑、植酸酶、復合酶等,而且幾乎只需投入幾萬元資金便可生產經營。
        另外,在工藝上固態發酵需要的供氧量相對要少得多,這是因為固體微粒之間的空隙較多,固體比面積大,與固體微粒接觸的空氣多等。但必須及時排除空隙中的二氧化碳和熱量,通過鼓風補充新鮮的空氣?偟膩碚f,固態發酵的成本、能耗要小得多。
    3.5 微生物菌體蛋白SCP的安全問題。
        在考慮微生物菌體蛋白時,安全性是至關重要的。致癌性芳香化合物(石化產品中)、重金屬、真菌毒素、病原性菌、感染性、遺傳性等。均應經過長期而充分的考慮。聯合國蛋白質咨詢小組PAG鑒于這一問題的重要性,提出了有關指導原則,對開發SCP方針提出了建議。
       在歐洲以國立機構為中心的對微生物蛋白質的毒性進行了詳細的試驗,并已轉向實用化。在日本,1970年12月厚生省食品衛生調查會石油酵母特別部會發表了36條22款的安全性標準。我國對SCP未作特別的檢驗標準,只是在需要時對技術進行鑒定時,才做“三致實驗”,但對食用蛋白新產品,卻有著嚴格的標準。
        通過動物試驗,現已確認,在微生物蛋白中含有較多的核酸、嘌呤堿基、正烷烴酵母中含有奇數碳原子的脂肪酸及殘留的烷烴等,在生理學和病理學方面均無問題。
        對于固態發酵生產的蛋白飼料來說,產品經小試出來,應做以下的毒性毒理實驗,方可上市:
    3.5.1 產品的急性和非急性毒性試驗。
    3.5.2 微核試驗。
    3.5.3 Ames試驗。
    3.5.4 Sce試驗。
    3.5.5 黃曲霉毒性化驗(黃曲霉毒素B1小于5ppm)
    3.5.6 產品用Oxoid CM145葡萄球菌110號培養基測定致病性葡萄球菌;用Oxoid CM133/164去氧膽酸鈉瓊脂測大腸桿菌;用Oxoid CM329改良煌綠瓊脂測沙門氏菌;用焦性沒食子酸氫氧化鈉培養法測定厭氧菌。
    3.5.7 有毒微量元素測定。
    3.5.8 薄層分析法分析雜色曲霉素,3、4-苯并芘,亞硝胺,比色法分析曲酸。
         在確認各項指標安全后,進行動物喂養試驗,以進行胴體解剖,飼料報酬,日增重,抗病性,蛋白消化率,代謝能,消化能等測定。
    4    固體發酵特點與固體發酵微生物
      固態發酵飼料在我國飼料工業中占據了一定的比重。年規模已經達到幾十萬噸以上,而正如前所述,僅利用我國食品與發酵行業的廢渣糟,可產生蛋白飼料近1000萬噸,再加上可資利用的各種農副產品及下腳料,可利用資源非常豐富。加上近年來該行業的發展,已積累了豐富的技術與經營經驗,故而發展潛力巨大,有可能成為我國飼料與環保工業中的一支新軍。
    4.1 固態發酵的微生物生理特點。
        在自然界中,微生物生長除了必須有營養物質供應外,還必須具備相應的物理化學環境,例如這些營養物質還必須有與微生物細胞內滲透壓相平衡的物理化學狀態,才能使微生物開始增殖。例如在液體培養中,在含有高濃度的食鹽(或蔗糖)的培養基中,由于細胞外部的高滲透壓,引起質壁分離,隨著細胞內物質的向外泄漏,微生物便會死亡或受到抑制,鹽漬罐頭和糖水罐頭不易變質,便是這個道理。根據同樣的原理,在固體基質的表面,并不是所有的微生物都能生長,因為固態發酵水分少,微粒表面的營養物和營養鹽濃度是很高的,只有那些具有一定的耐高滲透壓性能的微生物才能正常生長,例如霉菌、酵母、及放線菌中的一些菌株。
         一般來說,霉菌和扣囊擬內孢霉酵母,皮狀絲孢酵母等可以在含有適度水分的固體基質表面生長良好,但許多細菌卻由于細胞內滲透壓沒有霉菌那么高,而僅能在含有適度營養物質的液體中生長,(部分耐高滲的球菌除外)。事實上,固體發酵也大多是用霉菌和酵母來發酵的。
         固態發酵即是耐高滲透壓環境中的發酵,一些典型的例子是制酒行業中的制曲,醬油行業中的制曲,以及豆豉,酵母飼料等。目的分別以獲得高量的淀粉酶活性、蛋白酶活性、酵母細胞數及豐富的生物活性物質為主。霉菌和酵母等能在比較干涸的基質表面生長,而細菌等雜菌的污染度很小,固體培養就是這樣一種巧妙的培養方法。

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