強微乳酸糞腸球菌對膽鹽和胃液及腸液的耐受性試驗研究報告
江西農業大學江西省高校動物營養重點實驗室 南昌瞿明仁 330045
宜春強微生物科技有限公司 宜春鐘啟平 336000
筆者注：本試驗是探討強微復合菌中的乳酸菌部分，對膽鹽和胃腸液的耐受性試驗，是強微公司與江西農大協同創新產學研合作項目之一。
摘要：隨著國家對動物飼料中添加藥的規范，以及烈性傳染性疾病的減少，飼料中添加藥物越來越少，為微生態制劑的應用提供了應用前景。為此，本文對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用進行了研究。
乳酸糞腸球菌是一種微生態制劑，主要成分是可與動物共生的有益微生物群，對于改善動物胃腸功能，促進生長和提高生產性能具有明顯的功能。在生產實踐中使用普遍或濫用抗生素及獸藥，耐藥性問題、獸藥殘留問題直接影響著我國動物性食品的質量，也影響了生微生態制劑在生產中的應用。因此國家對動物飼料中添加藥的控制也越來越嚴格，因此，研究、開發及應用新型微生態制劑是今后發展的方向，為此，筆者對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌進行了對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用研究，預期為微生態制劑在飼料中應用提供理論基礎。
對膽鹽的耐受能力不同濃度相差不大，但隨處理時間延長，存活率明顯下降；在處理3小時后，存活下降到40%。
乳酸糞腸球菌對牛瘤胃酸性耐受較強，尤其是對天然牛瘤胃液耐受性強，處理5小時后，仍有近70%的存活率；對人工胃液耐受性相對低一些，2小時后，存活率為60%左右，但處理5小時后，存活率降至28%。
本文為乳酸糞腸球菌對膽鹽和胃液及腸液的耐受性試驗結果。
1. 材料與方法
1.1、材料
1.1.1、藥物及主要試劑：無菌生理鹽水、1mol/L NaOH溶液由實驗室自行配制；鹽酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶購自長城生物公司。
1.1.2、培養基：LB培養基、HM（Mueller-Hinton）培養基，購自長城生物公司。
1.1.3、參照菌株：乳酸糞腸球菌標準菌株ATCC 29212；質控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購自南昌市長城生物有限公司。
1.1.4、試驗對象：乳酸糞腸球菌，由宜春強微生物科技有限公司提供。
1.2、方法：
1.2.1、不同膽鹽處理對乳酸糞腸球菌存活率的影響
取1g乳酸糞腸球菌分別加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的膽鹽溶液各9mL，混勻于室溫中分別處理30min、1h、2h、3h。
處理后溶液用無菌生理鹽水做10-1、10-2、10-3……10倍遞度稀釋，在10-5~10-6兩個稀釋度各取0.1mL，加入無菌平皿；同時取未經膽鹽處理的乳酸糞腸球菌也做10倍遞度稀釋，取10-5~10-6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50℃的MH培養基迅速傾注平皿，小心混勻。置37℃恒溫培養24小時，觀察并記數。以上樣品均重復兩次以上，以平均數為準。
乳酸糞腸球菌存活率=處理后活菌數/未處理活菌數×100。
1.2.2、乳酸糞腸球菌對胃液的敏感性實驗
取1g乳酸糞腸球菌分別加入人工胃液、牛胃液各9mL，混勻于室溫中分別處理于1h、2h、3h、4h、5h。
處理后溶液用無菌生理鹽水做10-1、10-2、10-3……10倍遞度稀釋，在10-5~10-6兩個稀釋度各取0.1mL，加入無菌平皿；同時取未經胃液處理的乳酸糞腸球菌也做10倍遞度稀釋，取10-5~10-6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50℃的MH培養基迅速傾注平皿，小心混勻。置37℃恒溫培養24小時，觀察并記數。以上樣品均重復兩次以上，以平均數為準。
乳酸糞腸球菌存活率=處理后活菌數/未處理活菌數×100。
1.2.3、乳酸糞腸球菌對腸液的敏感性實驗
取1g乳酸糞腸球菌加入腸液各9mL，混勻于室溫中分別處理于2h、4h、6h、8h、10h。
處理后溶液用無菌生理鹽水做10-1、10-2、10-3……10倍遞度稀釋，在10-5~10-6兩個稀釋度各取0.1mL，加入無菌平皿；同時取未經腸液處理的乳酸糞腸球菌也做10倍遞度稀釋，取10-5~10-6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50℃的MH培養基迅速傾注平皿，小心混勻。置37℃恒溫培養24小時，觀察并記數。以上樣品均重復兩次以上，以平均數為準。
乳酸糞腸球菌存活率=處理后活菌數/未處理活菌數×100。
2、結果
2.1、不同膽鹽處理對乳酸糞腸球菌存活率影響試驗結果
從圖表中可見，乳酸糞腸球菌在膽鹽處理后，隨時間延長，菌數均呈下降趨勢；而不同濃度來看，隨著膽鹽濃度上升，菌數基本是遵循膽鹽濃度越高，菌數越低的規律。從圖可見，在30min內，存活均比較高；在1-2小時是一個明顯的變化階段，到第3小時后，四個不同的膽鹽濃度下，菌均下降明顯，而且菌落比較接近。具體試驗結果見表1、表2和圖1、圖2。
表1：膽鹽處理后，乳酸糞腸球菌計數結果(單位: ×1010 CFU/g)
|
膽鹽濃度
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0.2%
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0.3%
|
0.4%
|
0.5%
|
|
處
理
時
間
|
0.5 h
|
1.96 ± 0.09
|
1.89 ± 0.07
|
1.84 ± 0.08
|
1.73 ± 0.12
|
|
1 h
|
1.72 ± 0.03
|
1.67 ± 0.14
|
1.66 ± 0.29
|
1.35 ± 0.15
|
|
2 h
|
1.50 ± 0.08
|
1.52 ± 0.06
|
1.37 ± 0.10
|
0.95 ± 0.19
|
|
3 h
|
0.72 ± 0.18
|
0.71 ± 0.05
|
0.58 ± 0.05
|
0.54 ± 0.12
|
注：未處理乳酸糞腸球菌計數=2.01×1010 CFU/g
表2：膽鹽處理后，乳酸糞腸球菌存活率
|
膽鹽濃度
|
0.2%
|
0.3%
|
0.4%
|
0.5%
|
|
處
理
時
間
|
0.5 h
|
（97.51±4.48）%
|
（94.03±3.48）%
|
（91.54±3.98）%
|
（86.07±5.97）%
|
|
1 h
|
（85.57±1.49）%
|
（83.08±6.97）%
|
（82.59±14.43）%
|
（67.16±7.46）%
|
|
2 h
|
（74.63±3.98）%
|
（75.62±2.99）%
|
（68.16±4.98）%
|
（47.26±9.45）%
|
|
3 h
|
（35.82±8.96）%
|
（35.32±2.49）%
|
（28.86±2.49）%
|
（26.87±5.97）%
|
圖1：不同濃度膽鹽處理后，菌數變化圖
圖2：不同濃度膽鹽處理后，乳酸糞腸球菌存活率變化圖
2.2、乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液、人工胃液的敏感性試驗結果
從表3、圖4、表3、圖4可見，乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強，通過天然牛瘤胃液處理3小時，存活仍有95%以上，到第5小時仍有66.5%的菌存活。而對人工胃液的耐受性明顯下降，經人工胃液處理1小時，存活率就下降到81%；第2小時，存活率就僅有61左右；第3小時后，又有近一半死亡，存活率僅37.93%；第4小時后，存活率不到30%。
表3：乳酸糞腸球菌耐天然牛瘤胃液試驗結果
|
牛瘤胃液處理時間
|
0 h
|
1 h
|
2 h
|
3 h
|
4 h
|
5 h
|
|
乳酸糞腸球菌活菌含量
（×1010CFU/g）
|
2.03±0.06
|
2.01 ± 0.32
|
1.95 ± 0.28
|
1.93 ± 0.08
|
1.48 ± 0.06
|
1.35 ± 0.70
|
|
乳酸糞腸球菌存活率（%）
|
100±2.96
|
99.01±15.76
|
96.06±13.93
|
95.07±3.94
|
72.91±2.96
|
66.5±0.34
|
表4：乳酸糞腸球菌耐人工胃液試驗結果
|
人工胃液處理時間
|
0 h
|
1 h
|
2 h
|
3 h
|
4 h
|
5 h
|
|
乳酸糞腸球菌活菌含量
（×1010CFU/g）
|
2.03 ± 0.06
|
1.66 ± 0.21
|
1.25 ± 0.07
|
0.77 ± 0.12
|
0.59 ± 0.14
|
0.57 ± 0.07
|
|
乳酸糞腸球菌存活率（%）
|
100±2.96
|
81.77±2.99
|
61.58±3.45
|
37.93±5.91
|
29.06±6.90
|
28.08±3.45
|
圖3：乳酸糞腸球菌在天然牛瘤胃液和人工胃液中存活率變化圖
2.3、乳酸糞腸球菌對人工腸液的敏感性試驗結果
結果顯示，乳酸糞腸球菌對人工腸液有一定的耐受性。在2小時內，存活率達98.16%；4小時后存活率仍有72.64%。但到第6小時后，存活率明顯下降，不到50%，到第8小時降到40%以下，10小時后，則降到30%以下。具體結果見表5、圖5。
表5：乳酸糞腸球菌耐人工腸液試驗結果
|
腸液處理時間
|
0 h
|
2 h
|
4 h
|
6 h
|
8 h
|
10 h
|
|
乳酸糞腸球菌活菌含量
（×109CFU/g）
|
4.35±0.07
|
4.27±0.60
|
3.16±0.33
|
2.10±0.06
|
1.73±0.09
|
1.26±0.08
|
|
乳酸糞腸球菌存活率（%）
|
100±1.61
|
98.16±13.79
|
72.64±7.59
|
48.28±2.96
|
39.77±4.43
|
28.97±3.94
|
圖5：乳酸糞腸球菌在人工腸液不同時間處理后的存活率變化圖
3：小結與討論
3.1、本菌對膽鹽的耐受能力與不同膽鹽濃度處理結果生存率相差不大，尤其是0.2%、0.3%、0.4%、三個膽鹽濃度處理后，差異不顯著；0.5%膽鹽濃度處理后，有一定的差異。但與處理時間密切相關，即處理時間越長，存活率下降明顯。在處理3小時后，存活均不到40%，考慮到乳酸菌的脆弱性，本試驗結果表明，本試驗乳酸糞腸球菌對膽鹽的耐受能力很強。
3.2、在對胃液敏感性試驗中發現，乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強，通過天然牛瘤胃液處理3小時，存活仍有95%以上，到第5小時仍有66.5%的菌存活。而對人工胃液的耐受性明顯下降，經人工胃液處理1小時，存活率就下降到81%；第2小時，存活率就僅有61左右；第3小時后，又有近一半死亡，存活率僅37.93%；第4小時后，存活率不到30%，在乳酸菌中，這個存活率是比較高的。
分析其原因可能與人工胃液是模真胃環境有關，在真胃環境中，胃酸濃度高，對乳酸糞腸球菌殺傷作用強；而在天然牛瘤胃液中，PH在中性，所以乳酸糞腸球菌存活率高。
3.3、本試驗結果發現，乳酸糞腸球菌對人工腸液的耐受性在4小時內比較強，與天然牛瘤胃液類似：處理2小時存活率98.16%，處理4小時后，存活率72.64%。而在4小時以上時，存活率就比較低，第6小時存活率48.28%，第10小時存活率僅28%，但很顯然，本試驗乳酸糞腸球菌在腸液中具有較強的生存率。
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